一、实验原理

蛋白提取试剂盒采用温和的细胞或组织裂解方法，以释放总蛋白，并通过特异性结合、离心分离和缓冲液洗脱等技术，去除如核酸、脂类等杂质，从而获得高纯度、高活性的目标蛋白。核心步骤包括：

1. 裂解： 裂解液（含去污剂、蛋白酶抑制剂等）破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白。

2. 离心去除碎片： 高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质。

3. 蛋白纯化： 通过离心柱或特异性结合树脂进行选择性吸附，杂质随废液排出。

4. 洗脱： 使用低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，避免变性。

二、材料准备

试剂盒： 蛋白提取试剂盒（适用于多种动物、植物细胞和组织样本）

自备材料：

• 新鲜样本（细胞、组织等）
• 预冷PBS缓冲液（货号：abs962）
• 离心机（可达到12,000xg）
• 冰盒或低温操作台
• 涡旋振荡器（货号：abs72001）
• BCA蛋白定量试剂盒（货号：abs9232）
• 液氮（组织样本需速冻）

三、实验步骤

所有裂解蛋白的步骤需在冰上或4℃进行：

1. 样本处理：- 对于细胞样本，离心收集细胞（1500xg, 3min），并用PBS洗涤2次，吸尽残留液体。- 对组织样本，切取10–50mg，在液氮中速冻后研磨成粉末。

2. 裂解： 根据不同提取试剂盒的说明书，加入200-500μL预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂），涡旋混匀，并在冰上裂解20-30分钟，每隔5分钟涡旋10秒。

3. 离心去碎片： 在12,000xg和4℃下离心10分钟，取上清（即为总蛋白）转移至新离心管。

4. 蛋白纯化： 将离心柱用平衡缓冲液预处理5分钟，离心并弃去废液。将裂解液上清加入离心柱，12,000xg离心1分钟，弃去废液，加入500μL洗涤缓冲液，离心1分钟，重复2次。

5. 洗脱蛋白： 加入50–100μL洗脱缓冲液，静置2分钟后离心1分钟，收集洗脱液（即目标蛋白）。

6. 蛋白保存： 将提取的蛋白样品分装到小离心管中，依据实验需求短期保存在-20°C，或长期保存在-80°C冰箱中，避免反复冻融。

四、结果分析

1. 浓度测定： 使用BCA法测定蛋白浓度，OD562计算浓度（标准曲线法）。

2. 纯度评估： 通过分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀比值（理想值18–20，若超过20则提示核酸残留）。

3. 电泳验证： SDS-PAGE电泳检测条带清晰度，无拖尾或杂带表明纯度较高。

五、常见问题及解决方案

问题 | 可能原因 | 解决方案- 蛋白得率低 | 裂解不充分或蛋白酶降解 | 延长裂解时间，增加裂解液体积；确保添加蛋白酶抑制剂- 洗脱液杂质多 | 洗涤步骤不彻底 | 增加洗涤次数或延长离心时间- 蛋白浓度过高/过低 | 样本量不匹配或洗脱体积不当 | 调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积- A₂₆₀/A₂₈₀比值异常 | 核酸或盐离子残留 | 增加洗涤次数，或使用核酸酶处理样本- 电泳条带模糊 | 蛋白降解或SDS未充分结合 | 全程低温操作，电泳前煮沸样本5分钟

六、注意事项

1. 全程低温操作（冰上或4℃环境），防止蛋白降解。2. 裂解液需现用现配，避免反复冻融。3. 组织样本需充分匀浆，避免未裂解细胞残留。

通过以上步骤，可以高效提取高纯度蛋白，适用于Western Blot、ELISA、质谱分析等下游实验。选择ag尊龙凯时的蛋白提取试剂盒，确保实验结果的可靠性与真实性，不断提升科研效率。